단백질 정량법 완전 비교

BCA, Bradford, Quant-iT™부터 형광 기반까지 바이오의약품 분석의 핵심 가이드

바이오의약품 개발에서 단백질 정량(protein quantitation)은 품질 관리와 기능 분석의 출발점입니다. 하지만 단백질의 종류나 수정 여부(예: PEGylation, Glycosylation)에 따라 정량 결과가 달라질 수 있어, 어떤 정량법을 선택하느냐에 따라 데이터의 신뢰도가 크게 바뀝니다.

오늘은 "A Comparison of Protein Quantitation Assays for Biopharmaceutical Applications" 논문을 바탕으로 6가지 대표적인 단백질 정량법(BCA, Bradford, CBQCA™, DC, Fluorescamine, Quant-iT™)의 장단점과 바이오의약품에서 주의할 점들을 정리해봤습니다.

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✅ 단백질 정량이 믿을 만한가?

ICH 가이드라인에 따르면, 단백질 정량은 구조 분석(CD 분석 등)이나 효능 평가, QC 품질 관리를 위한 핵심 지표입니다. 특히, 단백질 농도에 따라 스펙트럼 해석이 달라지며, 잘못된 정량은 전체 배치 실패로 이어질 수 있습니다.

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🔬 6가지 대표 단백질 정량법 비교

정량법기반 원리민감도 (LOD)정량 범위주요 단점

BCA	Cu²⁺ 감쇠 → 색반응	중간 (~100 ng)	2 logs	환원당 영향
Bradford	Coomassie Blue 결합	중간	1–2 logs	Lys, Arg, MW 민감
DC	알칼리 구리 + Folin	중간	2 logs	Tyrosine 비율 민감
CBQCA™	형광 염료 – 아민 반응	높음 (~10 ng)	3 logs	Glycine 등 간섭
Fluorescamine	형광 – 1차 아민 결합	높음	3 logs	pH 조건 예민
Quant-iT™	Detergent + 형광	높음	3 logs	구성 단백질 의존

 

📌 정리: 형광 기반(CBQCA™, Quant-iT™, Fluorescamine)은 민감도가 높고 범위가 넓지만, 구성성분이나 환경에 따라 편차가 큽니다. 반면, BCA나 DC는 반복성이 뛰어나고 표준화에 유리합니다.

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🧪 PEGylation과 Glycosylation이 정량에 미치는 영향

• PEGylation (PEG 수식화): BCA, Quant-iT™, CBQCA™, Fluorescamine 모두에서 10% 이하 신호 감소 관찰. PEG가 염료 접근성을 물리적으로 방해할 수 있음.
• Glycosylation (당화): RNase A와 B를 비교했을 때 모든 정량법에서 RNase A(비당화)의 신호가 더 높음. 특히 Bradford에서는 큰 차이 발생.

❗ 결론: 화학적 수식이 있거나 다양한 형태의 단백질을 정량할 경우, 비수식 형태와 동일한 기준으로 측정하면 큰 오차 발생 가능.

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⚠️ BSA 표준을 그대로 사용하는 위험성

대부분의 키트는 BSA(Bovine Serum Albumin)를 기준으로 표준 곡선을 제공합니다. 하지만 논문에 따르면 BSA와 실제 단백질의 응답값이 크게 차이날 수 있으며, 정확도에 영향을 줄 수 있습니다.

💡 가능한 경우 분석 대상 단백질 또는 유사한 구조의 단백질을 표준으로 사용하는 것이 바람직합니다.

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📈 정량 정확도를 높이기 위한 팁 5가지

1. 단백질의 수식 여부(PEG, glycan 등)를 먼저 확인하세요.
2. 형광 기반 or 흡광 기반을 용도에 따라 선택하세요.
3. 정량 범위(LOD, dynamic range)를 확인해 샘플량에 맞추세요.
4. 반복 정밀도 (intra-plate, inter-plate CV)를 비교하여 QC 용도에 적합한 방법을 선택하세요.
5. 표준 단백질(BSA) 사용시, 해당 단백질과 구조가 유사한지 고려하세요.

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📚 요약

• BCA와 DC는 재현성, 견고성이 높아 QC에 적합합니다.
• CBQCA™, Fluorescamine, Quant-iT™는 민감도가 높고, 소량 단백질 측정에 적합합니다.
• PEGylation, Glycosylation은 정량 결과에 영향을 미치며, 형광 기반 정량법에서 민감하게 반응합니다.
• BSA를 모든 상황에서 표준으로 사용하면 오차가 발생할 수 있습니다.

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