E. coli Plasmid DNA 메틸화가 Restriction Enzyme에 미치는 효과

 

E. coli 플라스미드 DNA 메틸화 상태 검출 방법

이론

E. coli에서 플라스미드를 클로닝했는데 Restriction enzyme이 이상하게 작동하지 않았던 경험이 있나요? 보이지 않는 원인은 바로 DNA 메틸화—특히 Dam과 Dcm 메틸화효소에 의한 변형입니다. 이 효소들은 DNA에 메틸기를 추가해 일부 제한효소는 차단하지만 다른 효소들은 정상적으로 작동하게 합니다.

그렇다면 메틸화 상태를 확인하려면 어떻게 해야 할까요? 이 가이드에서는 다음 내용을 다룹니다:

• 실험실 검증된 3가지 방법으로 Dam/Dcm 메틸화 확인하기
• dam-dcm- 형질전환 세포 사용 시기
• 진단 도구로 활용하는 메틸화 의존적 절단 (DpnI 처리 같은)
• 실패한 효소 처리 문제 해결법

메틸화 검사가 중요한 이유

대부분의 실험실 E. coli 균주(DH5α, TOP10, BL21)는 Dam+/Dcm+으로, 다음 부위에서 DNA를 메틸화합니다:

• GATC 부위 (Dam 메틸화)
• CCWGG 부위 (Dcm 메틸화)

이것은 다음과 같은 경우 문제가 됩니다.

• 사용하는 제한효소가 메틸화에 민감할 때 (예: BamHI, MboI)
• 메틸화에 민감한 PCR 산물을 클로닝할 때
• 플라스미드 준비물이 다운스트림 실험에서 예측 불가능하게 작동할 때

방법 1: 제한효소 처리 분석

원리

일부 효소는 비메틸화 DNA만 자르는 반면, DpnI 같은 효소는 메틸화가 필요합니다. 처리 패턴을 비교해 메틸화 상태를 추론할 수 있습니다.

단계별 프로토콜

1. E. coli 균주에서 플라스미드 DNA 추출 (일반 미니프렙으로 가능).
2. 두 가지 병렬 처리 준비:
   • 처리 A: 메틸화 민감 효소 사용 (예: MboI, GATC 부위가 비메틸화된 경우만 자름).
   • 처리 B: DpnI 사용, 메틸화된 GATC만 자름.
3. 처리된 DNA를 아가로스 젤에서 전기영동.

결과 해석

결과	메틸화 상태
MboI는 자르고 DpnI는 자르지 않음	DNA는 GATC에서 비메틸화됨
DpnI는 자르고 MboI는 자르지 않음	DNA는 Dam 메틸화됨
둘 다 자르지 않음	DNA/효소에 문제 가능성 (문제 해결 필요!)

방법 2: PCR + 시퀀싱

이 방법을 사용하는 경우

• 플라스미드에 메틸화 검사를 위한 제한효소 인식 부위가 거의 없거나 없는 경우
• 메틸화 상태를 확실하게 확인해야 할 때

단계

1. GATC 또는 CCWGG 부위를 포함하는 프라이머 설계.
2. 플라스미드에서 해당 부위 PCR 증폭.
3. PCR 산물 시퀀싱 (생어 시퀀싱).
4. 크로마토그램에서 메틸화 신호 분석:
   • Dam 메틸화 (GᵐATC): 변형된 염기에서 피크 불균형 나타날 수 있음.
   • Dcm 메틸화 (CᵐCWGG): 시퀀싱 결과에 비슷한 이상 신호.

방법 3: 메틸화 민감 qPCR

고처리량 실험실에 적합

이 방법은 효소 처리나 시퀀싱 없이 메틸화 차이를 검출합니다.

작동 원리

1. DNA를 중아황산나트륨으로 처리해 비메틸화 시토신을 유라실로 전환 (메틸화 시토신은 그대로 유지).
2. 다음과 같은 프라이머로 qPCR 수행:
   • 중아황산나트륨 처리된 (비메틸화) DNA
   • 처리되지 않은 (메틸화) DNA
3. C_t 값 비교로 메틸화 수준 추정.

dam-dcm- 형질전환 세포 사용 시기

검사를 통해 메틸화가 실험을 방해한다고 확인되면 다음으로 교체하세요:

• JM110 (dam-/dcm-)
• SCS110 (dam-/dcm-)
• NEB ER2925 (dam-/dcm-)

이 균주들은 메틸화 문제를 제거해 다음을 보장합니다:

• 안정적인 제한효소 처리
• 메틸화에 민감한 삽입물의 정확한 클로닝

핵심 요약

• 효소 처리 실패 시 문제 해결 전에 메틸화 검사를 먼저 하세요.
• Dam/Dcm 메틸화는 MboI 같은 효소를 차단하지만 DpnI에는 필수입니다.
• 시퀀싱과 qPCR은 효소 없이도 메틸화를 확인하는 방법입니다.
• dam-dcm- 균주는 대부분의 메틸화 관련 클로닝 문제를 해결합니다.

마무리

메틸화 검사는 후생유전학 실험실만의 전유물이 아닙니다—원활한 분자생물학 실험을 위한 일상적인 점검입니다. 이제 메틸화를 탐지하고 우회하는 방법을 알았으니, 고집 센 제한효소 처리도 문제없습니다.

추가 정보가 필요하면 다음 자료를 참고하세요:

• NEB 메틸화 민감도 표
• 메틸화 없는 클로닝 가이드