키트 없이 홈브루 골든 게이트 클로닝: BsaI-HFv2, Esp3I, BsmBI-v2 효소 비율 최적화
골든 게이트 어셈블리는 강력한 분자 클로닝 기술이지만, 상업용 키트는 비쌀 수 있습니다. 상업용 키트 없이도 고효율, 저배경 클로닝을 할 수 있는 방법을 알려드리겠습니다. 이 가이드에서는 BsaI-HFv2, Esp3I, BsmBI-v2 효소와 T4 ligase를 사용한 최적화 방법을 상세히 설명합니다.
골든 게이트 어셈블리에서 효소 비율이 중요한 이유
골든 게이트는 BsaI-HFv2 같은 Type IIS 효소가 DNA를 자르고, T4 ligase가 다시 연결하는 과정으로 이루어집니다. 하지만 균형이 맞지 않으면 다음과 같은 문제가 발생합니다:
- 불완전한 절단 (절단되지 않은 백본)
- 높은 클론 background (빈 벡터)
- 어셈블리 실패 (잘못 조합된 프래그먼트)
해결책은 효소 비율, 반응 조건, 버퍼 선택을 정밀하게 조절하는 것입니다.
BsaI-HFv2, Esp3I, BsmBI-v2의 최적 효소-라이게이즈 비율
1. BsaI-HFv2: 골든 게이트의 표준
- 권장 비율: 20 µL 반응당 15 U BsaI-HFv2 + 500 U T4 ligase
- 이유: 라이게이즈가 너무 많으면 배경이 증가하고, 너무 적으면 효율이 떨어집니다.
- 버퍼: 일반 T4 ligase 버퍼 사용 가능
예시 프로토콜:
- 1.5 µL BsaI-HFv2 (10 U/µL)
- 0.25 µL T4 ligase (2000 U/µL)
- 2 µL 10x T4 ligase 버퍼
- 50 fmol 벡터 + 50 fmol 인서트
- 20 µL까지 증류수 추가
반응 조건:
- 1-2개 인서트: 37°C에서 5-60분, 이후 60°C에서 10분 (효소 비활성화)
- 다중 프래그먼트 (2-10개): 37°C 1분 + 16°C 1분을 30회 반복, 마지막에 60°C에서 5분
2. Esp3I: 더 까다로운 대안
Esp3I도 사용 가능하지만 BsaI-HFv2나 BsmBI-v2보다 배경이 높은 편입니다.
- 권장 비율: 20 µL 반응당 30 U Esp3I + 750 U T4 ligase
- 버퍼: T4 ligase 버퍼 사용, 효소 안정성을 위해 BSA (0.1 mg/mL) 추가
3. BsmBI-v2: 고효율 업그레이드
10개 이상의 프래그먼트를 조립할 때는 BsmBI-v2가 Esp3I보다 성능이 좋습니다.
- 권장 비율: 20 µL 반응당 30 U BsmBI-v2 + 750 U T4 ligase
- 중요 차이점: 37°C가 아닌 42°C에서 절단
골든 게이트 일반 문제 해결
1. 클론 background가 너무 많나요?
- 원인: 라이게이즈 과다, 불충분한 절단, 또는 절단되지 않은 벡터
- 해결책:
- T4 ligase 양 줄이기 (예: 1000 U 대신 500 U 사용)
- 60°C에서 10분 반응 추가 (효소 비활성화에 중요)
- 벡터 젤 정제로 절단되지 않은 DNA 제거
2. 절단이 불완전한가요?
- 원인: 효소 활성 저하, 잘못된 버퍼, 또는 반응 시간 부족
- 해결책:
- 37°C 반응 시간 연장 (기본 5분에서 10-15분으로)
- BSA (0.1 mg/mL) 추가로 효소 안정화
- 버퍼 호환성 확인 (예: BbsI-HF는 CutSmart 버퍼 + ATP 필요)
단계별 홈브루 골든 게이트 프로토콜
1. 반응 혼합물 준비 (20 µL)
- 15 U BsaI-HFv2 (또는 30 U BsmBI-v2)
- 500 U T4 ligase (BsaI 사용시) 또는 750 U (BsmBI/Esp3I 사용시)
- 2 µL 10x T4 ligase 버퍼
- 50 fmol 벡터 + 50 fmol 인서트
- 20 µL까지 증류수
2. 반응 실행
- 1-2개 인서트: 37°C 30-60분, 이후 60°C 10분
- 3개 이상 인서트: 37°C (BsmBI는 42°C) 1분 + 16°C 1분을 30회 반복, 마지막에 60°C 5분
홈브루 골든 게이트 완벽 마스터하기
비싼 상업용 키트 없이도 스마트한 최적화로 골든 게이트를 성공할 수 있습니다. 다음 사항을 조절하세요:
- 효소-라이게이즈 비율 (BsaI 15U:T4 ligase 500U)
- 반응 조건 (다중 프래그먼트시 37°C + 16°C 사이클링)
- 문제 해결 (60°C 비활성화, BSA 추가 등)
이렇게 하면 90% 이상의 성공률과 최소한의 배경을 달성할 수 있습니다.
