Site-Directed Mutagenesis를 만드는 간단한 방법

 

 

Q5 Site-Directed Mutagenesis

Site-Directed Mutagenesis(SDM)는 플라스미드 DNA에 특정 변이를 도입할 수 있는 분자생물학의 핵심 기술입니다. 유전자 기능 연구, 단백질 구조 분석, 코돈 최적화 등에 활용되며, 정밀한 유전자 변형을 가능하게 합니다.

Site-Directed Mutagenesis란?

SDM은 플라스미드 내에서 뉴클레오티드의 삽입, 삭제 또는 치환을 가능하게 합니다. 주요 응용 분야:

• 유전자 발현 연구
• 단백질 구조/기능 분석
• 번역 후 변형 연구
• 전사 인자 결합 부위 조절
• 제한 효소 인식 부위 생성/제거
• 코돈 최적화

Q5 Site-Directed Mutagenesis 키트(NEB #E0552)는 강력한 고정밀 PCR 기반 워크플로우로 이 과정을 쉽게 만들 수 있습니다.

 

프라이머 설계 전략

1. Overlapping Primer Design

Overlapping Primer 디자인은 고전적인 방법으로 중첩 서열을 가진 프라이머를 사용하여 PCR 후 닉이 있는 원형 플라스미드를 생성합니다. 생성물에 닉이 있더라도 E. coli에 중간 정도의 효율로 형질전환이 가능합니다. PCR 후 DpnI(NEB #R0176)을 사용하여 메틸화된 원본 템플릿을 제거함으로써 새로 합성된 플라스미드만을 보존합니다.

2. Back-to-back Primer Design

이 방법은 선형 PCR 산물을 생성한 후 다시 circular form으로 만드는 방법입니다. 템플릿 사용 효율이 더 높으며, 최대 100bp의 큰 삽입이 가능합니다. 삽입 서열을 순방향과 역방향 프라이머 사이에 분할하여 설계합니다. 또한 Overlapping Primer 방법보다 10-100배 적은 template으로도 사용이 가능합니다.

 

Mutagenesis를 위한 Primer Design

SDM 실험의 성공은 효과적인 Primer Design에 달려 있습니다. 주요 가이드라인:

• 치환(Substitutions): 변이 부위를 프라이머 중앙에 위치시켜 안정성과 특이성 보장
• 삭제(Deletions): 제거할 서열을 둘러싸는 프라이머 설계
• 소규모 삽입(<6 nt)(Small Insertions (<6 nt)): 하나의 프라이머에 직접 삽입
• 대규모 삽입(최대 100 nt)(Large Insertions): 삽입 서열을 양쪽 프라이머에 분할(~50 nt씩), 상보적 서열 보장

 

The KLD Reaction: Kinase, Ligase, DpnI

PCR 후 선형 산물은 플라스미드 재원형화를 위해 KLD 반응을 거칩니다

1. Kinase: 5' 말단 인산화
2. Ligase: 닉을 봉합하여 원형 분자 형성
3. DpnI: 부모(메틸화된) DNA 템플릿 소화

 

NEBaseChanger: 프라이머 설계 도구

NEB의 NEBaseChanger는 점突变, 삽입, 삭제를 위한 프라이머 설계를 간편하게 해주는 온라인 도구입니다. 서열과 원하는 변이를 입력하기만 하면 자동으로 설계해줍니다.

Transformation Tip

SDM 생성물은 대부분의 chemically competent E. coli 균주에 직접 형질전환 가능합니다. 주의사항:

• 플라스미드 크기와 형질전환 방법에 따라 효율 차이 발생
• Ligase 없는 프로토콜은 콜로니 수 감소 가능
• 전기천공법 사용 시 투석 또는 버퍼 교환을 통한 저염 농도 유지

Q5® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase 사용 시:

• 치환 또는 삭제 실험에서 일반적으로 수천 개의 콜로니 생성, >90% 정확도
• ORF 말단에 6X His-tag(18 nt) 삽입 시 500개 이상의 콜로니 생성, 모두 정확하게 확인

Primer Disign은 SDM 성공의 핵심 요소입니다. NEBaseChanger 사용하길 추천드립니다..