Mastering Human and Bacterial rRNA Depletion with NEBNext Kits

Mastering Human and Bacterial rRNA Depletion with NEBNext Kits

RNA-Seq나 메타트랜스크립토믹스와 같은 고감도 RNA 분석 실험에서는 **리보솜 RNA(rRNA)**가 차지하는 비율을 줄이는 것이 매우 중요합니다. 특히, 인간(human)과 박테리아(bacterial) rRNA를 동시에 제거해야 하는 경우가 흔한데요. 이 글에서는 NEBNext v2 rRNA Depletion Kit를 활용하여 human + bacterial rRNA를 한 번에 효율적으로 제거하는 방법과, species-specific custom probe 제작 방법을 쉽고 자세히 설명드리겠습니다.

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1. rRNA Depletion의 중요성

많은 생체 시료에는 전체 RNA 중 rRNA가 80~90% 이상을 차지하기 때문에, 이를 그대로 사용하면 mRNA나 미생물 유래 non-coding RNA 같은 목적 RNA의 시그널이 묻혀버립니다.

• rRNA 제거 없이 진행된 RNA-Seq: 낮은 유효 리드(yield), 높은 배경 잡음
• 효과적인 rRNA Depletion: 더 깊은 전사체 정보, 비용 절감, 분석 정확도 향상

특히, human 조직에서 유래한 샘플에 **공생균(microbiome)**이나 **감염균(pathogen)**이 혼재된 경우, 인간과 박테리아 rRNA를 동시에 제거해야만 핵심 유전자 발현 데이터를 확보할 수 있습니다.

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2. NEBNext v2 rRNA Depletion Kit: Human + Bacterial 동시 Depletion

NEB에서 제공하는 NEBNext® v2 rRNA Depletion Kit을 잘 이용하면 인간과 박테리아 두 가지 종류의 rRNA를 한 번의 반응에서 동시에 제거할 수 있습니다.

1. 제품 구성
   • NEBNext v2 rRNA Depletion Solution (Human용 probe 포함): 2 μL
   • NEBNext Bacterial rRNA Depletion Solution (Bacteria용 probe 포함): 2 μL
   • 이 두 용액을 혼합하여(총 4 μL) 단일 반응에서 human + bacterial rRNA 제거 작업을 수행할 수 있습니다.
2. 실험 워크플로우 요약
   1. 총 RNA 추출 (예: Qiagen RNeasy Kit, Trizol 등)
   2. Human rRNA Depletion Solution 2 μL + Bacterial rRNA Depletion Solution 2 μL 혼합
   3. 혼합 probe 용액과 함께 rRNA 제거 반응 수행 (NEB 프로토콜 참고)
   4. rRNA가 제거된 RNA를 정제하고, 라이브러리 전처리(RNA-Seq library prep) 진행
3. 장점
   • 단일 튜브 반응으로 실험 간소화
   • 시간과 비용 절감: 두 번 나눠서 실험하지 않아도 됨
   • 높은 효율: NEB 특허 기반 probe 디자인으로 고감도 rRNA 제거

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3. 특정 종(Species)의 rRNA 제거가 필요할 때

만약에 분석 대상이 되는 특정 박테리아 종만을 대상으로 rRNA를 제거하고 싶다면, 프리디자인된 probe가 포함되지 않은 아래 제품을 활용할 수 있습니다.

• NEBNext® RNA Depletion Core Reagent Set
  • probe 미포함 형태로 제공되며, custom probe pool을 직접 설계해서 사용할 수 있습니다.
  • 원하는 종의 rRNA 시퀀스를 바탕으로 NEBNext Custom RNA Depletion Design Tool을 통해 custom probe를 제작할 수 있습니다.
  • 기존 Human rRNA Depletion Kit와 함께 혼합 사용 가능합니다.

1. Custom Probe Pool 설계 절차
   1. 분석 대상 종의 rRNA 시퀀스 확보 (예: NCBI rRNA 데이터베이스)
   2. NEB 공식 웹사이트의 **Custom RNA Depletion Design Tool**에 rRNA 시퀀스를 넣고, probes 디자인
   3. FITC-labeled 혹은 5’biotinylated 등 NEB 규격에 맞춘 probe 주문
   4. 주문한 custom probe pool을 받아서, Core Reagent Set의 depletion 솔루션에 섞어서 사용
2. Custom Probe 사용 가이드
   • NEB가 제공하는 Guidelines for use of Custom RNA Depletion Probe Pools with the NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set 문서를 참고하면, probe 농도, 반응 온도/시간, 정제 방법 등 자세한 권장 조건이 나와 있습니다.

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4. Bacterial Species Compatibility 정보 확인하기

• NEBNext Bacterial rRNA Depletion Kit을 구매하기 전, 원하는 박테리아 종이 패널에 포함되어 있는지 확인해야 합니다.
• NEB 공식 Bacterial rRNA Depletion Kit (Bacteria) Species compatibility 페이지에서 호환 가능한 박테리아 리스트를 확인할 수 있습니다.
• 리스트에 없는 종은 Custom RNA Depletion Core Reagent Set를 통해 직접 probe를 디자인하면 됩니다.

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5. rRNA Depletion 이후의 워크플로우

1. rRNA 제거 확인
   • Bioanalyzer나 TapeStation을 이용하여 rRNA 피크 감소를 확인합니다. 컨트롤 샘플(제거 전)과 비교 시, 28S/18S rRNA 피크가 거의 사라진 것을 볼 수 있습니다.
   • Qubit이나 Nanodrop로 총 RNA 농도를 측정하고, rRNA 제거 후 RNA 손실 정도를 평가합니다.
2. RNA-Seq 라이브러리 prep
   • rRNA 제거된 RNA를 NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit와 같은 라이브러리 키트에 투입하여 cDNA 합성 → 어댑터 연결 → PCR 증폭 단계로 넘어갑니다.
   • 이때, 남아있는 rRNA-fragment가 많지 않기 때문에, 라이브러리 품질이 상당히 개선됩니다.
3. Sequencing 및 데이터 분석
   • Illumina나 Oxford Nanopore 등 플랫폼에서 시퀀싱 후, non-rRNA reads만을 대상으로 유전자 발현 정량이나 미생물 커뮤니티 분석을 진행합니다.
   • rRNA 비율이 낮을수록 유효 리드 수가 증가하여, 샘플 당 비용을 절감할 수 있습니다.

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6. FAQ: 자주 묻는 질문

Q1. Human과 Bacterial rRNA 제거를 한 번에 하면 효율이 떨어지지 않나요?
NEBNext v2 키트는 human 전용 probe와 bacterial 전용 probe를 최적 비율로 혼합해 사용할 수 있도록 설계되었습니다. 따라서, 동시에 실행해도 개별적으로 진행했을 때와 거의 동등한 제거 효율을 보여줍니다.

Q2. Custom probe를 디자인할 때 고려해야 할 점은 무엇인가요?

1) 추출한 rRNA 시퀀스의 커버리지: 가능한 한 전체 rRNA 유전자 영역을 커버하도록 probe를 설계해야 합니다.
2) GC 함량과 melting temperature (Tm): Tm이 서로 큰 차이가 나지 않도록 GC 함량을 고려해 probe 길이를 조정합니다.
3) Probe 길이: 보통 50~120 nt 사이로 디자인하며, 너무 짧으면 특이성이 낮고, 너무 길면 온도 최적화가 어려울 수 있습니다.
4) 교차 반응성(Cross-reactivity): 유사 시퀀스를 가진 다른 RNA에 bind하는 것을 방지하기 위해 BLAST 확인을 수행해야 합니다.

Q3. Bacterial species compatibility 페이지에 내가 원하는 종이 없으면 어떻게 해야 하나요?

해당 종이 호환성 리스트에 없는 경우, NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set를 사용해 직접 probe를 디자인하는 방법밖에 없습니다. NEB 사이트의 Custom RNA Depletion Design Tool을 통해 원하는 시퀀스로 probe를 주문하면 됩니다.

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7. 마무리 및 추천 팁

• 샘플 준비 단계에서 **RNA 품질(RIN 값)**이 충분히 높아야, rRNA 제거 후에도 충분한 양의 mRNA를 얻을 수 있습니다.
• 반응 온도, 혼합 시간, probe 농도 등은 NEB 프로토콜을 참고하되, 샘플 특성(예: 미생물 복합체 여부)에 따라 최적화를 수행하는 것을 권장드립니다.
• Custom probe를 사용한 실험을 처음 진행할 때는, 소량(소위 test tube 한두 개 분)으로 파일럿 실험을 해보고, 제거 효율을 먼저 확인하는 것이 좋습니다.

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더 읽어볼 자료

NEBNext v2 rRNA Depletion Kit 프로토콜

Custom RNA Depletion Probe Pool 가이드라인

Bacterial rRNA Depletion Kit Species Compatibility