NEB LAMP Detection Methods 가이드: pH-Based vs. Fluorescent

소개

LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) 실험을 준비하면서 여러 가지 검출 방법 때문에 고민해본 적 있으신가요? 진단 검사나 연구 프로젝트를 진행할 때, 적합한 LAMP 키트와 검출 방식을 선택하는 것이 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다. 이 가이드에서는 NEB의 WarmStart® LAMP 제품군—pH 기반의 컬러리메트릭(Colorimetric) 믹스부터 형광 검출 키트까지—의 모든 것을 설명하고, 프라이머, 염료, 대체 판독 방법에 대한 자주 묻는 질문에도 답변해 드립니다. 그럼 시작해볼까요?

1. LAMP 이해하기: 검출 방법이 중요한 이유

어떤 LAMP 반응은 선명한 노란색으로 변하고, 어떤 반응은 형광 채널에서 반짝이는 이유가 궁금하셨나요? 사실 검출 전략은 결과 해석 방식뿐만 아니라 감도, 속도, 그리고 편리성에도 큰 영향을 줍니다. 일반적인 LAMP 반응에서는 고활성 DNA 중합효소가 일정 온도(60–65 °C)에서 타겟 DNA를 증폭하면서, 양성 반응 시 생성되는 부산물(양성자 또는 마그네슘 피로인산염)을 다음과 같은 다양한 방식으로 시각화할 수 있습니다:

1. pH 변화 (Phenol Red)
2. 탁도 (Magnesium Pyrophosphate 침전물)
3. 컬러리메트릭 염료 (HNB, Malachite Green, EBT, Bromo PAPS)
4. 형광 염료 (NEB #B1700)

이 중 어떤 방식을 선택할지는 실험 워크플로우, 사용 가능한 기기, 그리고 정량이 필요한지(형광) 아니면 단순히 양/음 여부를 확인할지(색 변화) 여부에 달려 있습니다.

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2. NEB의 pH 기반 컬러리메트릭 LAMP 키트

2.1 pH 기반 컬러리메트릭 검출이란?

pH 기반 컬러리메트릭 LAMP는 Phenol Red이라는 pH 지시약을 사용하여, DNA 합성으로 인해 생성된 양성자가 반응액에 축적되면 색이 핑크 → 노랑으로 변화합니다. NEB의 특수하게 설계된 믹스는 저버퍼링 환경을 제공하므로, 작은 pH 변화도 쉽게 눈으로 확인할 수 있습니다.

왜 pH 기반일까요?

• 육안 판독 가능 & 장비 불필요: 튜브만 보면 됩니다.
• 빠른 해석: 양성 반응은 선명한 노랑으로 변합니다.
• 비용 절감: 실시간 기기가 없어도 가능합니다.

2.2 NEB 제품군

• M1800S/L WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA)
• M1804S/L WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG

주요 차이점:

• M1804 키트에는 UDG (Uracil-DNA Glycosylase)가 포함되어 있어, 프라이머에 우라실을 사용했을 때 오염을 방지합니다.
• 두 키트 모두 Phenol Red가 미리 섞여 있어, 프라이머와 템플릿, 증류수만 넣고 65 °C에서 반응시키면 색이 핑크 → 노랑으로 변하는지 확인할 수 있습니다!

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3. NEB의 형광 기반(Non–pH 컬러리메트릭) LAMP 키트

3.1 형광 LAMP 검출이란?

형광 LAMP는 증폭된 DNA에 결합하는 DNA-intercalating dye를 이용하여, SYBR/FAM 채널에서 형광을 방출합니다. 이를 통해 실시간 또는 엔드포인트에서 반응을 정량할 수 있어, 감도가 높고 반응 동력을 분석할 수도 있습니다.

3.2 NEB 제품군

• E1700S/L WarmStart® LAMP Kit (DNA & RNA)
• E1708S/L WarmStart® Fluorescent LAMP/RT-LAMP Kit (with UDG)
• M1708S/L WarmStart® Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X Master Mix (with UDG) (염료 없음)

중요 포인트:

1. E1700 / E1708 키트
   – NEB #B1700 LAMP Fluorescent Dye가 기본으로 포함되어 있습니다.
   – E1708는 UDG가 포함되어 오염을 방지합니다. E1700은 UDG 미포함입니다.
   – SYBR 채널이 있는 기기에서 바로 사용할 수 있습니다.
2. M1708 믹스 (염료 없음)
   – 형광 염료가 포함되지 않은 완제품 믹스입니다.
   – 이미 다른 염료(HNB, Malachite Green 등)를 사용하고 싶을 때 적합하며, 직접 최적화가 필요합니다.

3.3 LAMP Fluorescent Dye (NEB #B1700)는 어떻게 작용하나요?

NEB #B1700 염료는 증폭된 이중가닥 DNA에 결합하여 약 500 nm 부근에서 형광을 방출합니다. 반응당 0.5 µL만 넣으면 되며, 250 µL 제품 한 병으로 약 500 rxn을 수행할 수 있습니다(소형 50 µL 제품은 약 100 rxn 사용 가능).

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4. 대체 컬러리메트릭 지시약 (염료가 필요한 키트의 옵션)

M1708과 같이 염료가 포함되지 않은 믹스를 사용할 때, 또는 추가적 판독 방법이 필요하다면 다음의 엔드포인트 지시약을 활용할 수 있습니다:

지시약	최종 농도	색 변화	비고
Hydroxynaphthol Blue (HNB)	120 µM	보라색 → 파란색	Millipore Sigma (CAS #63451-35-4)에서 구입 가능. 사용자가 별도 구매.
Malachite Green	0.004% (w/v)	투명 → 초록색	증류수에 용해 후 사용. 참고 문헌: Malachite Green을 이용한 LAMP 육안 검출.
Eriochrome Black T (EBT)	120 µM	보라색 → 하늘색	A₆₄₀/A₅₇₀ 비율을 측정하여 증폭 여부를 확인해야 합니다.
Bromo PAPS + MnCl₂	50–100 µM + 100 µM MnCl₂	투명 → 붉은색/주황색 변화	금속 감지 염료; 피로인산염과 Mn²⁺가 결합할 때 색 변화가 일어납니다.
탁도 (Turbidity)	추가 시약 불필요	맑음 → 탁도 (침전물)	650 nm에서 흡광도 측정 필요. 반응 시간을 60분으로 연장해야 합니다.
Phenol Red (pH 기반)	M1800/M1804 믹스에 미리 포함	핑크 → 노랑	저버퍼링 환경으로 pH 변화가 육안으로 선명하게 나타납니다.

팁: TB Green® 또는 SYBR Green으로 형광 염료를 대체하려면, 염료 농도를 최적화하고 기기 호환성을 반드시 확인해야 합니다. NEB #B1700는 SYBR/FAM 채널에서 검증된 염료이지만, 대체 염료는 NEB에서 검증되지 않았습니다.

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5. 자주 묻는 질문 (FAQ)

Q1: “Primer Explorer로 LAMP 프라이머를 디자인했는데, NEB LAMP 키트를 문제없이 사용할 수 있나요?”

A1: 물론입니다! Primer Explorer 전용 프로토콜은 없지만, NEB LAMP (온라인 프라이머 디자인 툴)을 통해 결과를 비교해볼 수 있습니다. NEB LAMP Resources 페이지에는 LAMP 프라이머 사용법 및 교육 자료가 있으니, 이를 참고하시면 최적화에 큰 도움이 됩니다.

Q2: “WarmStart LAMP Kit (DNA & RNA)와 Colorimetric LAMP 2X Master Mix는 염료 사용이 어떻게 다른가요? NEB #B1700는 500 rxn에 충분한가요?”

A2:

• WarmStart LAMP Kit (DNA & RNA) (E1700)은 형광 염료(NEB #B1700)가 반드시 필요합니다. 반응당 0.5 µL를 사용하며, 250 µL 제품 한 병으로 약 500 rxn을 처리할 수 있습니다. 소형 50 µL 제품은 약 100 rxn이 가능합니다.
• WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA) (M1800)은 염료 불필요합니다. pH 기반 Phenol Red만으로 양성 반응을 판독할 수 있습니다.

Q3: “형광 염료가 포함된 키트에서 TB Green 또는 SYBR Green으로 대체할 수 있나요?”

A3: TB Green이나 SYBR Green은 NEB에서 검증된 적이 없습니다. NEB #B1700는 SYBR/FAM 채널에서 사용 가능하지만, 다른 염료를 사용하려면 염료 농도 최적화와 기기 설정 확인을 반드시 진행해야 합니다. 대체 염료는 NEB가 검증한 프로토콜이 아니므로, 자체적으로 제어 실험을 통해 안정성을 확인하세요.

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6. NEB 키트를 이용한 LAMP 실험 단계별 가이드

1. 프라이머 디자인
   – NEB LAMP 또는 Primer Explorer를 사용해 4–6개의 프라이머(F3, B3, FIP, BIP ± 루프 프라이머)를 생성합니다.
   – 최적 온도 범위는 60–65 °C이며, 이차 구조가 생기지 않도록 주의하세요.
2. 반응 혼합물 준비
   – pH 기반 믹스 (M1800/M1804):
     • 12.5 µL 2X Master Mix (Phenol Red 포함)
     • 2.5 µL 프라이머 믹스 (총 프라이머 농도 약 2–2.5 µM)
     • X µL 템플릿 (정제된 DNA/RNA 1–10 ng)
     • 증류수로 최종 부피 25 µL 맞춤.
   – 형광 믹스 (E1700/E1708):
     • 12.5 µL 2X Master Mix (NEB #B1700 포함)
     • 2.5 µL 프라이머 믹스
     • X µL 템플릿
     • 증류수로 25 µL 부피 맞춤.
   – 염료 없음 믹스 (M1708):
     • 12.5 µL 2X Master Mix
     • 2.5 µL 프라이머 믹스
     • X µL 템플릿
     • 선택한 염료 추가 (예: 0.5 µL NEB #B1700 또는 120 µM HNB).
     • 증류수로 최종 부피 25 µL 맞춤.
3. 반응 진행
   – 65 °C에서 30분 (형광 검출 시) 또는 60분 (탁도·컬러리메트릭 검출 시) 반응시킵니다.
   – HNB, Malachite Green, EBT 등을 사용할 때는 반응 완료 후 실온으로 식혀 주면 색 변화가 더 뚜렷해집니다.
4. 결과 판독
   – M1800/M1804 (Phenol Red): 핑크 → 노랑으로 색 변화를 확인합니다.
   – E1700/E1708 (형광): SYBR/FAM 채널에서 실시간 또는 엔드포인트 형광 신호를 측정합니다.
   – M1708 + HNB: 보라색 → 파란색으로 색 변화를 확인합니다.
   – M1708 + Malachite Green: 투명 → 초록색으로 색 변화를 확인합니다.
   – M1708 + EBT: 보라색 → 하늘색으로 색 변화를 확인하며, A₆₄₀/A₅₇₀ 비율로 증폭 정도를 정량화합니다.
   – 탁도(650 nm): 650 nm에서 흡광도 측정을 통해 탁도 생성을 확인합니다. 탁도가 생기면 증폭이 성공했다는 의미입니다.

7. 최적의 LAMP 성능을 위한 팁

• 프라이머 품질: 최상의 결과를 위해 항상 HPLC 정제 프라이머를 사용하세요.
• 템플릿 농도: 너무 많은 템플릿은 비특이적 증폭을 유발할 수 있으니 1–10 ng 정도를 목표로 하세요.
• 반응 시간: 신호가 약하다면 10–15분 정도 반응 시간을 연장하되, 비특이적 산물을 주의하세요.
• UDG 오염 방지: 이전에 생성된 증폭 산물을 연속적으로 사용해야 한다면 UDG 함유 키트 (M1804 또는 E1708)를 선택하여 오염을 최소화하세요.
• 대체 염료 검증: TB Green 또는 SYBR Green으로 대체할 때는 표준 곡선을 작성해 선형성을 확인하고, 반응 저해 여부를 검증하세요.
• 음성 대조군: 항상 무템플릿 대조(NTC)를 포함하여 오염 여부를 조기에 발견하세요.

8. 결론

요약하자면, NEB의 WarmStart® LAMP 제품군은 다양한 워크플로우에 맞춘 검출 방법을 모두 제공합니다:

• M1800 / M1804 (pH 기반 Phenol Red) → 육안 판독 가능, 기기 불필요.
• E1700 / E1708 (형광) → 정량 분석, 실시간 모니터링.
• M1708 (염료 없음) → 사용자 맞춤형 (HNB, Malachite Green, EBT, Bromo PAPS 등 선택 가능).

각 방법의 장단점—속도, 감도, 장비 필요성, 비용—을 이해하면 프로젝트에 맞는 최적의 키트를 자신 있게 선택할 수 있습니다.

이제 LAMP 실험을 시작할 준비가 되셨나요? 검출 방식을 결정하고, 프라이머를 디자인(NEB LAMP 또는 Primer Explorer 사용)한 뒤, NEB WarmStart 시약으로 신뢰할 수 있는 증폭 결과를 얻으세요. 성공적인 실험을 기원합니다!