DNA 조각화부터 PCR 사이클 최적화까지

안녕하세요! 바이오 블로그에 오신 것을 환영합니다. 여러분은 혹시 차세대 염기서열 분석(NGS)에 대해 얼마나 알고 계신가요? NGS는 생명 과학 연구의 판도를 바꾼 혁신적인 기술이지만, 그 복잡한 과정 때문에 많은 분들이 어려움을 느끼시곤 합니다. 특히 NGS 라이브러리 제작은 성공적인 분석을 위한 핵심 단계로, 여기서의 작은 실수 하나가 전체 실험을 망칠 수도 있습니다.

 

그래서 오늘은 NGS 라이브러리 제작의 두 가지 핵심 요소인 DNA 조각화(fragmentation)와 PCR 사이클 최적화에 대해 자세히 알아보는 시간을 가질 거예요. 이 글을 통해 여러분의 NGS 실험이 한 단계 더 성공적으로 진행될 수 있도록, 제가 가진 모든 노하우를 아낌없이 풀어놓겠습니다. 자, 그럼 시작해볼까요?

NGS 시퀀싱 성공의 첫걸음- DNA Fragmentation

NGS 라이브러리를 제작할 때 가장 먼저 해야 할 일은 바로 DNA 조각화입니다. DNA 조각화는 원하는 크기의 DNA 단편(fragment)을 무작위로 만드는 과정이에요. 왜 이렇게 복잡한 과정을 거쳐야 할까요? 그 이유는 NGS 플랫폼이 특정 크기의 DNA 단편에 최적화되어 있기 때문입니다.

 

일반적으로 NGS 플랫폼에서는 150~600 bp 범위의 단편을 size selection을 통해 선택하게 됩니다. 이 과정을 통해 시퀀싱 효율을 극대화하고 정확한 결과를 얻을 수 있죠.

 

특히 cfDNA(cell-free DNA)나 이미 손상이 심한 DNA의 경우에는 추가적인 DNA 조각화 단계가 필요 없을 수도 있습니다. 이 점은 매우 중요해요! 이미 잘게 쪼개져 있는 샘플에 인위적인 조각화를 가하면 오히려 DNA 손상을 가중시키고 라이브러리 수율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 일반적인 gDNA 샘플은 분자량이 크기 때문에, NGS 기기에 적합한 길이를 만들기 위해 반드시 조각화가 필요하다는 점을 잊지 마세요.

 

그렇다면 DNA 조각화는 어떻게 이루어질까요? 크게 두 가지 방법이 사용됩니다.

• 물리적 방법: 초음파 분쇄(sonication)나 Covaris 시스템을 이용하는 방식입니다. 이 방법은 정교한 조절이 가능하지만, 고가의 장비가 필요하다는 단점이 있습니다.
• 효소적 방법: NEBNext® Ultra™ II FS DNA Module (예: E7810)이나 NEBNext UltraShear® (NEB)와 같은 효소 기반의 간편한 분절 방법입니다. 이 방법은 물리적 방법에 비해 간편하고 재현성이 뛰어나다는 장점이 있어 최근 많이 사용되고 있습니다. 특히, NEBNext® Ultra™ II FS DNA Library Prep Kit for Illumina® (E7645/E7103)는 별도의 DNA 조각화 단계를 함께 사용할 수 있도록 설계되어 있어 편리성을 더합니다.

실험실 환경과 샘플의 특성에 따라 최적의 조각화 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 시판되는 다양한 제품군을 비교하여 여러분의 실험 목적에 가장 적합한 제품을 선택해 보세요.

DNA fragmentation 요약

• NGS 시퀀싱에 적합한 DNA 단편 크기(150-600 bp)를 만들기 위한 필수 과정.
• cfDNA나 손상된 DNA는 추가 조각화 불필요.
• 물리적(초음파) 또는 효소적(NEBNext® Ultra™ II FS 등) 방법 사용.
• 실험 환경과 샘플에 맞는 최적의 방법 선택이 중요.

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정확한 SNP 분석을 위한 PCR 사이클 수 최적화

DNA 조각화가 끝났다면 이제 다음 단계는 PCR(Polymerase Chain Reaction)입니다. 특히 인간 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 분석과 같은 민감한 실험에서는 PCR 사이클 수를 최소한으로 유지하는 것이 가장 중요하다고 전문가들은 강조합니다. 왜 그럴까요? PCR 사이클이 많아질수록 증폭 오류가 발생할 가능성이 높아지고, 이는 결국 분석 결과의 정확도를 떨어뜨리기 때문입니다.

 

하지만 샘플의 양이 매우 적다면 PCR 사이클을 늘려야 할 수도 있습니다. 이럴 때는 어떻게 해야 할까요?

 

처음 실험을 진행할 때는 프로토콜에서 권장하는 PCR 사이클 수를 기준으로 삼는 것이 좋습니다. 그 후, 라이브러리 수율이 충분하다면 권장 사이클 수에서 1~2회 정도 줄여보는 것을 추천합니다. 이렇게 함으로써 불필요한 증폭 오류를 최소화하고 정확도를 높일 수 있습니다.

만약 충분한 DNA가 확보되지 않아 최소 3 cycle은 라이브러리 제작을 위해 위함 최소 사이클이며, 권장 사이클은 3사이클이니 그 미만으로 할 수 없습니다.

특히, NEBNext® Ultra™ II DNA PCR-free Library Prep Kit for Illumina® | NEB 제품처럼 PCR 없이 진행할 수 있는 방법도 있으니, 가능한 경우 이러한 PCR-free 방법을 고려하는 것도 좋은 전략입니다. 이러한 방법은 UMI(Unique Molecular Identifiers)가 포함된 UDI 인덱스(Unique Dual Index)를 사용하므로, 라이브러리 식별 및 오류 감소에 더욱 효과적입니다.

 

반대로 샘플 농도가 매우 낮은 경우에는 권장 사이클 수를 유지해야 합니다. 그리고 나서 TapeStation 또는 Bioanalyzer와 같은 장비를 통해 QC(Quality Control)를 진행하여 라이브러리 QC를 설정할 수 있습니다. PCR 사이클에 대한 가이드는 있지만, 샘플과 시퀀싱 플랫폼에 따라 최적의 사이클 수가 달라질 수 있다는 점을 기억해야 합니다.

 

만약 Upper band 위로 bubble product band가 보인다면 사이클 수를 최적화해야 할 수 있습니다. PCR cycle은 실험을 통해서 최적화하시면 좋을 것 같습니다. 이는 PCR 과정에서 원치 않는 부산물(primer dimer 등)이 생성되었음을 의미할 수 있으며, 이 경우 PCR 사이클을 줄이거나, primer 농도를 조절하는 등의 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.

PCR 사이클 최적화 요약

• SNP 분석 등 민감한 실험에서는 PCR 사이클 최소화가 중요 (증폭 오류 방지).
• 권장 사이클 수 기준으로 시작, 수율 충분 시 1~2회 감소.
• 샘플 양이 매우 적으면 3 사이클 이상 필수.
• NEBNext® Ultra™ II DNA PCR-free Library Prep Kit처럼 PCR-free 방법도 고려.
• TapeStation/Bioanalyzer로 QC하며 최적 사이클 수 결정.
• Upper band 위 bubble product band는 PCR 사이클 최적화 필요 신호.

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성공적인 NGS 실험을 위한 최적화

지금까지 NGS 라이브러리 제작의 핵심인 DNA 조각화와 PCR 사이클 최적화에 대해 자세히 알아보았습니다. 이 두 과정은 단순히 기술적인 단계를 넘어, 정확하고 신뢰할 수 있는 NGS 데이터를 얻기 위한 필수적인 요소입니다.

 

물론, NGS 실험은 복잡하고 고려해야 할 변수가 많습니다. 하지만 오늘 제가 알려드린 팁들을 잘 활용하고, 여러분의 샘플 특성과 실험 목표에 맞춰 꾸준히 최적화 과정을 거친다면 분명 성공적인 결과를 얻으실 수 있을 거예요.