혈액을 떠다니는 "종양 DNA(circulating tumor DNA)"의 발견과 기능

혈액에는 다양한 성분들로 구성되어 있으며, 이것들을 통해 우리 몸 상태가 어떤지 평가하기도 합니다. 대표적으로 HDL, LDL등 다양한 지표들을 통해 우리 몸의 건강을 확인 할 수 있습니다. 그중에 지금까지는 잘 몰랐고, 일반적으로 피검사로 알 수 없는 <circulating tumor DNA>에 대해 알아보고자 합니다. 다시 말해 우리 몸 어딘가 생긴 암이 죽으면서 밖으로 나온 암 유례 DNA가 있다는 것입니다. 그것을 통해 우리는 암을 진단, 치료에 유용한 자료로 사용할 수 있습니다. 최신의 기술이지만 아직까지는 많이 알려지지 않은 내용을 간략히 알아보려고 합니다.

 

 

1. Cell-free DNA(cfDNA): clinical significance and utility in cancer

1) Early Discovery and applications of cfDNA

circulating tumor DNA를 이해하기 앞서 cell-free DNA를 먼저 이해하셔야합니다. 동일하게 혈액을 떠다니는 DNA가 맞지만 그 기원이 다릅니다. 암에서는 오는 DNA가 있는 반면에 일반 세포에서 나온 DNA가 있습니다. 이들을 구별하는 방법은 NGS를 이용하는 방법이 있지만 그것은 나중에 다루도록 하겠습니다. 오늘 주 내용은 cfDNA 발견과 기능에 대해서 알아보겠습니다. 

 

• 1948년 mandel과 metais에 의해 혈장에서 발견되었음.
• 1965년 Bendich와 동료들은 암 전이와 cfDNA와 관계에 대해 연관되어있을 거로 가설을 세움. 그리고 1966년 Tan과 동료들이 처음으로 cfDNA와 질병과 관계를 확인함. (systemic lupus erythematosus 환자 혈액에서 높은 레벨의 cfDNA를 검출함)
• 1977년 처음으로 leon과 동료들이 암환자에서 정상보다 cfDNA 레벨이 높다는 것을 radioimmunochemistry로 확인함, 하지만 왜 cfDNA 레벨이 높은 지는 잘 알 수 없었고, 기술의 발달로 그 DNA가 cancer에서 나온 DNA라는 것이 밝혀짐
• 1990년대 두 그룹에서 암 특이적인 변이(N-RAS in pancreatic adenocarcinoma and acute myelogenous leukemia)를 보고함. cfDNA는 일반적으로 정상 DNA에 희석되어 변이 된 DNA를 검출하기에 충분치 않는 민감성을 가진다. PCR으로만 검출하였으며, cfDNA를 검출하는 것이 진단, 치료반응 예측, 예후 예측에 사용 가능할 것으로 생각하기 시작함.
• 이후 microsatellite marker 상태와 loss of heterozygosity (LOH), gene amplification, oncogenic viral DNA 존재 확인, tumor suppressor gene의 promoter 부위의 hypermethlation 등등 여러가지 cfDNA에서 DNA 변화를 확인할 수 있었음. 이런 특징들은 암 유전체를 분석하는데 유용한 것을 알았으나 기술적인 한계가 있었음.
• cfDNA의 응용은 혈액에서의 정상과 종양의 DNA가 섞여 있다는 것부터 시작된다. 가장 성공적인 발견은 어머니의 혈액에서 태아유래의 DNA가 높은 레벨로 혼합되어 있다는 것을 Lo와 동료들이 발견하였다. 같은 그룹에서 남자아이를 임신한 여성의 70%에서 혈액에서 Y 염색체 서열이 검출되었다. 이런 발견을 통해 cfDNA 기반으로 태아 유전자 검사법이 개발됨.

2) Properties of cfDNA

• cfDNA의 주된 출처는 cell death임. cfDNA는 이중가닥이면 150bp 정도의 길이로 절단되어 있음. 이런 길이는 neclosome이 가지고 있는 DNA 길이와 매치된다. (two unit: 300bp, three unit: 450bp 길이를 가짐)
• 2003년 Wang과 동료들은 cfDNA의 온전성(integrity)은 cancer와 연관되어 있다는 것은 밝혔음. 61명 breast와 gynecologic cancer 환자의 beta-actin 유전자의 100bp와 400bp 길이의 PCR 산물이 65명의 non-neoplastic 환자보다 cfDNA integrity가 더 좋았음. 하지만 반대되는 연구결과도 많음.
• Madhavan과 동려들은 260bp Alu와 100bp LINE의 농도 비율을 측정한 결과 암환자에서 cfDNA integrity가 낮았으며 cfDNA integrity와 암 결과와 상관있었음. 저자는 'cfDNA integrity의 감소'는 높은 apoptotic rate과 관련되어있으며, 높은 apoptotic rate은 높은 종양의 증식 (proliferation)과 관련있음을 언급하였음. 결국, 암 환자에서 cfDNA의 주된 원인은 apoptotic cell이지, necrotic cell은 아님. 세포의 증식과 apoptosis사이의 관계는 는 잘 밝혀져있으므로 종양의 높은 증식력에 의해 종양에서 유례하는 cfDNA가 높은 비율을 차지하고 있음. (총 cfDNA의 90%는 150-180bp 길이를 가짐)
• 암 환자들에서 cfDNA 농도는 다양하게 나타남. 2008년 Fleischhacker와 Schmidt의 리뷰에서 34개의 결과를 정리함. 암환자의 혈액에서의 cfDNA 농도가 정상보다 높은 농도를 가지는 경향성을 보였음. 하지만 암환자의 cfDNA의 레벨은 매우 다양하게 나타나면 종양에서 유래한 ctDNA (circulating tumor DNA)의 비율 또한 다양한 게 나타남.
• 2001년 Jahr와 동료들은 처음으로 총 cfDNA에서 ctDNA가 차지하는 비율이 얼마인지 확인하려고 시도함. ctDNA/cfDNA 비율은 tumor-specific한 hypermethylated CDKN2A promoter를 정량하여 계산하였음. 25명 중 11명의 환자에서 CDKN2A의 hypermethylation이 검출되었고, 어떤 환자는 cfDNA의 10% 이하를 차지하는 것이 나타난 반면에 어떤 환자는 90% 이상의 비율을 차지하여 매우 범위가 다양하다는 것을 확인하였음.
• 4년 뒤, Diehl과 동료들은 33명의 대장암환자에서 cfDNA에서 ctDNA 비율이 0.01-1.7% 임을 보고 하였음. 재미있게도, 이 논문에서 APC 유전자의 PCR의 산물이 1,295에서 100bp로 떨어질 때 APC 유전자의 변이 비중(%)은 5에서 20배까지 증가되는 것을 보고 함.
• cfDNA의 중요한 특성으로는 빠르게 turnover된다는 것임. 1963년 Tsumita와 Iwanaga는 동물 혈액의 외래 DNA 청소율을 보고하였음. 마우스에 방사성 물질로 표지 된 DNA를 주입했을 때 30분 후에 99%의 DNA가 사라졌고 방사성 물질이 신장에서 가장 높게 나타났으며, 뒤로 간과 비장에서 방사성 물질이 검출되었다. 신장이 cfDNA clearance에 중요하다는 것을 보여줌.
• 1999년 Lo와 동료들은 어머니의 혈액에서 태아의 cfDNA의 반감기를 측정하였음. SRY 유전자를 RT-PCR을 사용하여 확인한 결과 태아의 DNA는 16.3의 반감기를 가졌으며 2시간 후에는 검출이 되지 않았음.
• Fatouros와 동료들은 운동선수가 결렬한 운동을 할때 cfDNA가 운동 후 15배까지 증가되는 것을 확인하였고, 30분 후에 13배 증가된 상태로 유지되고 이후에 정상상태로 돌아갔음.
• cfDNA clearance에 대한 이견은 없지만 자세한 메카니즘은 아직 연구가 부족한 상태임.

3) Collection and Processing of Blood for cfDNA

• 환자마다 cfDNA 레벨의 차이가 큰 것이 보고되고 있고, 이런 차이는 환자마다는 생물학적 차이에서 기인한다고 생각함. 그러므로 분석하기 위해서는 샘플이 동일하다고 생각하면 안 되며, cfDNA를 분석하기 위한 여러 가지 방법을 고려해야 함.
• cfDNA의 오염의 주된 원인은 파괴된 혈구들에 의한 것임이 밝혀져 있음.

 

 

2. cfDNA quality에 영향 미치는 요인

• Serum에서의 cfDNA 레벨이 plasma보다 높음. cfDNA의 양과 품질은 monocyte의 lysis에 의해 크게 영향을 받음. plasma는 이론적으로는 혈구 DNA에 의한 오염이 적지만, 혈액 수집과 centrifugation사이의 시간 차이는 cfDNA에 크게 영향을 미침. cfDNA가 오염되었는지 아닌지 평가하는 방법 중 가장 좋은 방법은 cfDNA의 길이가 apoptotic 한 특징과 일치하지 않는 큰 분자량의 DNA 조각이 상대적으로 높다면 오염된 것으로 판단할 수 있음.
• 이런 오염을 피하기 위해서는 EDTA tube를 이용하여 혈액을 채집하고 2시간 이내에 1,600 rpm으로 두 번 centrifugation을 하여 plasma를 분리하는 것임. Heparin tube는 ctDNA 검출 방법에 사용하기 어려움. 그 이유는 heparin이 polymerase 활성에 영향을 미쳐 sensitivity에 심각한 영향을 미침. 혈액의 처리를 빠르게 하는 것이 가장 좋으며, Streck의 cfDNA BCT tube를 이용하는 방법은 2주 정도까지 lysis를 방지하며, 오염을 최소화하는데 적절한 방법임.

 

3. Biological Role of cfDNA

• 70년의 역사를 가지고 있는지 cfDNA의 기능은 면역반응과 혈액응고에서만 밝혀진 상태이며, 아직도 모호한 부분이 많음.

circulating_tumor_DNA_cfDNA